洪恒飛 科技日報記者 江耘

(相關資料圖)

腎細胞癌起源于腎小管上皮的惡性腫瘤，是泌尿系統(tǒng)的常見腫瘤疾病，發(fā)病原因尚不明確。根據(jù)國際癌癥研究中心數(shù)據(jù)庫GLOBOCAN統(tǒng)計，2020年全球腎細胞癌的發(fā)病率居惡性腫瘤第14位，死亡率居第15位。其中，中國新發(fā)腎癌約7.3萬例，且仍呈上升趨勢。

腎透明細胞癌則是腎細胞癌中最常見的病理亞型。由于其復雜的腫瘤微環(huán)境，當前多種臨床治療策略的臨床表現(xiàn)仍有待提升。深入刻畫腎透明細胞癌微環(huán)境中的細胞組成和基因組調(diào)控特征，對于理解腫瘤致病機理和開發(fā)新的治療策略具有重要意義。

不久前，浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院泌尿外科文甲明主任醫(yī)師、王博涵副主任醫(yī)師課題組聯(lián)合西湖實驗室謝琦研究員團隊，利用單細胞多組學技術揭示了腎透明細胞癌中的關鍵調(diào)控程序，發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點。相關研究論文發(fā)表在國際期刊《細胞發(fā)現(xiàn)》。

勘察腫瘤微環(huán)境需要打開新視角

由腫瘤細胞、免疫細胞、間質(zhì)細胞、細胞外基質(zhì)及各種因子構成的腫瘤微環(huán)境，是非常復雜的生態(tài)環(huán)境。腎透明細胞癌的腫瘤微環(huán)境具有高異質(zhì)性：同一惡性腫瘤在不同患者個體間或者同一患者體內(nèi)不同部位腫瘤細胞間以及不同臨床階段中，都存在很大差異，使得靶向治療和免疫治療對一部分患者初始就不敏感或者最終產(chǎn)生耐藥性。

所謂靶向治療，是指在細胞分子水平，針對主要的致癌相關分子設計相應的治療藥物，藥物進入體內(nèi)后特異性選擇致癌分子發(fā)生作用，下調(diào)受體的表達或下游基因的活化，達到程序化逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞分化的能力，或間接靶向腫瘤新生血管，使腫瘤細胞缺血而死亡。

“腎癌的靶向治療藥物主要有兩大類，一類是以血管內(nèi)皮生長因子受體為靶點的酪氨酸激酶抑制劑，另一類是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白。”文甲明介紹，這兩類藥物都能起到抗血管生成的作用，從而治療腎癌。

腎癌的免疫治療主要依靠免疫檢查點抑制劑。免疫檢查點是免疫細胞產(chǎn)生的調(diào)節(jié)自身免疫功能的蛋白小分子，一類免疫抑制性的分子，可以調(diào)節(jié)免疫反應的強度和廣度，從而避免正常組織的損傷和破壞，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，免疫檢查點成為免疫耐受的主要原因之一。

“無論是單一的抗血管生成靶向藥物，還是單一的免疫檢查點抑制劑，或是兩者聯(lián)用，目前表現(xiàn)都是在部分患者中有一定療效，但在一部分患者無明顯獲益，甚至出現(xiàn)較為明顯的毒副反應。” 文甲明說。

近年來，單細胞測序技術飛速發(fā)展，已經(jīng)能夠檢測出單個細胞的基因轉(zhuǎn)錄表達和表觀基因組調(diào)控等多種維度的信息。

文甲明表示，這種單細胞水平的多維度信息能夠以更高分辨率和更廣的視角來幫助解析組織發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展的關鍵因素，或是腎透明細胞癌腫瘤微環(huán)境的有利勘探工具。

腎透明細胞癌的單細胞轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)可及性圖譜 科研人員供圖

從數(shù)萬個單細胞中識別特殊蛋白質(zhì)

此前，國外科研團隊曾針對健康的腎臟組織，運用單細胞核轉(zhuǎn)錄組測序(scRNA-seq)和單細胞染色質(zhì)可及性實驗技術(scATAC-seq)，刻畫過在腎臟發(fā)育過程中基因表達和表觀基因組調(diào)控的特征，并識別出驅(qū)動腎小管細胞分化和近端小管上皮細胞亞群轉(zhuǎn)換的關鍵調(diào)控因子。

“以往的研究并未在基因組水平刻畫腎透明細胞癌的特征，聯(lián)合團隊嘗試直接應用單細胞多組學技術來解析腎透明細胞癌，進一步打開腎透明細胞的單細胞多維度視角。”文甲明表示。

此次研究中，聯(lián)合團隊具體采用了4例腎透明細胞癌患者的手術標本進行研究，對患者的腫瘤組織進行了配對的scRNA-seq和scATAC-seq測序，分別獲得的38，097和21，272個單細胞。

通過單細胞數(shù)據(jù)分析，聯(lián)合團隊識別了多種淋巴細胞和髓系細胞亞群聯(lián)合腎透明細胞癌標志基因CA9和拷貝數(shù)變異特征，在兩種數(shù)據(jù)類型中各鑒定出了一個腫瘤細胞群體。

“總的來說，實驗獲取的單細胞中，免疫細胞是腎透明細胞癌微環(huán)境中主要的細胞群體，占比大于70%，腫瘤細胞只占不到10%，還有一些正常組織細胞。”文甲明介紹。

通過設計嚴格的篩選策略，并結合公開的人類癌癥基因組圖譜計劃數(shù)據(jù)庫（TCAGA-KIRC），科研人員識別了4個腫瘤細胞特異富集且顯著和病人更差預后生存相關的轉(zhuǎn)錄因子，具體為蛋白HOXC5、 VENTX、 ISL1和OTP。

基于scATAC-seq捕獲到的染色質(zhì)開放信息，科研人員進一步識別出了這些轉(zhuǎn)錄因子的下游靶基因并構建了其表觀調(diào)控網(wǎng)絡，分析發(fā)現(xiàn)，這些轉(zhuǎn)錄因子的靶基因顯著富集于低氧和細胞增殖信號通路，且包含多個在腫瘤細胞群體中顯著高表達的基因FXYD2和CRYAB。

此外，結合先前的scRNA-seq數(shù)據(jù)，科研人員發(fā)現(xiàn)這些靶基因特異性地富集于腫瘤細胞群體。

發(fā)現(xiàn)腎透明細胞癌潛在治療靶點

為進一步調(diào)查這些調(diào)控因子對腫瘤細胞的影響，科研人員分別在腎細胞癌細胞系和異種移植小鼠腫瘤模型中分別敲低這幾個轉(zhuǎn)錄因子，即下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子表達水平后發(fā)現(xiàn)能夠顯著抑制腫瘤細胞的生長。

“我們將人源腫瘤細胞系注射到免疫缺陷小鼠的皮下后產(chǎn)生腫瘤，即為異種移植小鼠腫瘤模型，以模擬腫瘤細胞在體內(nèi)的生長能力。”文甲明解釋說。

同時，結合國際公開的小分子化合物擾動數(shù)據(jù)庫LINCS10，科研人員篩選出了2個已被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準用于疾病治療的藥物進行對照試驗。

科研人員分別在兩個鑒定出的腎細胞癌細胞系培養(yǎng)過程中，將篩選出來的藥物按提前摸索好的濃度加入到細胞培養(yǎng)基中，作為藥物處理組，同時在對照組中向培養(yǎng)基中加入與藥物處理組等量體積二甲基亞楓，藥物處理兩天后，收集藥物處理組和對照組細胞，檢測HOXC5、ISL1和VENTX的轉(zhuǎn)錄水平。

經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，藥物處理組的HOXC5，ISL1和VENTX的轉(zhuǎn)錄水平明顯低于對照組。基于此，科研人員將敲低了轉(zhuǎn)錄因子的腎細胞癌細胞系和對照組的腎細胞癌細胞系，同時以同樣數(shù)量注射到免疫缺陷小鼠皮下，一段時間后，敲低轉(zhuǎn)錄因子組的皮下腫瘤明顯小于對照組小鼠。科研人員即認為敲低轉(zhuǎn)錄因子能明顯抑制腎細胞系細胞在體內(nèi)的生長能力 。

記者了解到，科研人員對經(jīng)藥物處理組、對照組的腎細胞癌細胞，檢測細胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)藥物處理組與對照組相比，腎細胞癌細胞體外增殖速度明顯減慢。

此外，科研人員刻畫了對各個免疫細胞亞群的轉(zhuǎn)錄程序和表觀特征，并在腫瘤細胞和免疫細胞亞群間識別出了多對具有潛在臨床意義的配體-受體互作對。

“本次研究描繪了腎透明細胞癌的單細胞轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組圖譜，識別了腫瘤細胞特異的基因轉(zhuǎn)錄和表觀調(diào)控程序，可為設計更有效的治療策略提供新的線索。”文甲明表示。

關鍵詞： 腎透明細胞癌