迄今為止，人類還無法從單個(gè)堿基分辨率水平上檢測(cè)到脫氧尿嘧啶(dU)。這成為DNA序列檢測(cè)的盲區(qū)和瓶頸之一，嚴(yán)重阻礙了對(duì)dU功能的認(rèn)知和對(duì)DNA遺傳密碼的理解。

1月17日，中科院院士、同濟(jì)大學(xué)教授陳義漢課題組和同濟(jì)大學(xué)研究員馬紅輝課題組、復(fù)旦大學(xué)研究員胡晉川課題組共同在《美國化學(xué)會(huì)志》發(fā)表文章。研究人員借助一種特殊的酶分子，發(fā)明了靈敏性好、特異性強(qiáng)和分辨率高的DNA檢測(cè)技術(shù)，第一次用酶法在單堿基分辨率水平上精準(zhǔn)檢測(cè)DNA中的dU，實(shí)現(xiàn)了DNA中dU堿基檢測(cè)技術(shù)的根本性突破。

突破測(cè)序瓶頸

眾所周知，DNA是生物體的遺傳密碼。通常認(rèn)為它們包括腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)等4個(gè)堿基。后來的研究發(fā)現(xiàn)，DNA中還存在另外的堿基dU。這些堿基共同組成了DNA的基本元素。

“從原核生物到真核生物，從單細(xì)胞生物到人類，除A、T、G和C外，它們的DNA中還包含著比例不等的dU。但是迄今為止，人類還難以從單堿基分辨率水平上檢測(cè)到dU，這阻礙了對(duì)dU功能的認(rèn)知和對(duì)DNA遺傳密碼的理解。”陳義漢告訴《中國科學(xué)報(bào)》。

在艾滋病病毒的DNA中，每20個(gè)堿基就有一個(gè)以上的dU;在瘧原蟲的DNA中，dU占?jí)A基的比例約為十萬分之一。dU既能通過C堿基脫氨產(chǎn)生，又能“冒充”T堿基摻入到基因組中。

由于缺乏敏感又特異的單堿基分辨率dU測(cè)序技術(shù)，人們不能像其他堿基(A、T、G和C)那樣實(shí)現(xiàn)dU在DNA中的精準(zhǔn)定位。

“也就是說，現(xiàn)在的dU檢測(cè)技術(shù)可以證實(shí)若干堿基中存在dU堿基，但不能確定dU堿基位于哪些具體的堿基之間。”論文第一作者、同濟(jì)大學(xué)博士研究生江柳丹對(duì)《中國科學(xué)報(bào)》說，“dU堿基的生物學(xué)意義是什么?dU堿基在疾病發(fā)生發(fā)展中的意義又是什么?要回答這些問題，必須取得單堿基分辨率水平上dU堿基檢測(cè)和定位的突破。不能在單堿基分辨率水平上精準(zhǔn)定位堿基，就無法從DNA序列層面推斷堿基編碼的氨基酸和蛋白質(zhì)序列。”

精準(zhǔn)“釣捕” 化敵為友

dU具有“雙面性”——有時(shí)是人類健康的朋友，有時(shí)又可能化身為人類健康的敵人。

“很多報(bào)道發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體面對(duì)不同抗原時(shí)，免疫細(xì)胞需要dU作為中間體，產(chǎn)生多種多樣的抗體，幫助抵御諸如新冠病毒之類的病原體對(duì)人類的侵害。”論文共同通訊作者馬紅輝說，“而當(dāng)腫瘤或心血管疾病患者體內(nèi)出現(xiàn)dU時(shí)，則可能導(dǎo)致患者的基因組不穩(wěn)定，加速病情發(fā)展。”

顯然，精準(zhǔn)檢測(cè)dU在DNA中的分布情況，將有助于評(píng)估人類個(gè)體的生理學(xué)機(jī)能和疾病的預(yù)后。然而，尋找DNA中dU的精確位置如同大海撈針。

研究人員經(jīng)過多年探索，最終發(fā)明了優(yōu)越的單堿基分辨率的dU測(cè)序技術(shù)。

馬紅輝介紹說，該測(cè)序技術(shù)首先要找到一個(gè)合適的“鉤子”—— 一類恥垢分枝桿菌來源、名為UdgX的新型糖苷酶。該糖苷酶能夠?qū)NA的dU切除，形成一個(gè)缺口，并同時(shí)與對(duì)應(yīng)的核糖形成共價(jià)鍵，最終將其捕獲。

作為“鉤子”的糖苷酶“釣”到含dU的DNA片段后，還需要進(jìn)一步確定dU位置。接下去，要發(fā)揮DNA高保真聚合酶特性。這個(gè)酶如同行駛在DNA軌道上的列車，當(dāng)碰到被這種糖苷酶標(biāo)記的dU缺口時(shí)，就會(huì)被動(dòng)地原地“停車”。

然后，研究人員結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，將“停車”信號(hào)放大，最終在單個(gè)堿基的水平上精確地定位dU在DNA乃至基因組上的位置。

酶法檢測(cè)優(yōu)勢(shì)明顯

為便于該測(cè)序技術(shù)的傳播和普及，研究人員將其命名為Ucaps-seq。從此，一個(gè)基于新型糖苷酶的在單堿基分辨率水平上的dU檢測(cè)技術(shù)誕生了。

基于該技術(shù)，人們可以像檢測(cè)DNA中的A、T、G和C那樣，精確檢測(cè)DNA中的dU。

“Ucaps-seq測(cè)序技術(shù)是國際上第一個(gè)酶法檢測(cè)DNA中的dU堿基的技術(shù)。”陳義漢說，“現(xiàn)存的dU測(cè)序技術(shù)均為化學(xué)法，酶法測(cè)序技術(shù)明顯優(yōu)于化學(xué)法測(cè)序技術(shù)。”

酶法測(cè)序技術(shù)靈敏性好、特異性強(qiáng)、分辨率高。此外，該技術(shù)還具有實(shí)際應(yīng)用中效率高、成本低，很少發(fā)生假陽性，也很少受到干擾因素影響的特點(diǎn)。例如，既有的dU化學(xué)測(cè)序技術(shù)需要先利用一種酶切除dU，使之成為無嘧啶的位點(diǎn)，而這樣的處理較難與DNA自身存在的無嘧啶位點(diǎn)區(qū)分，不可避免地導(dǎo)致假陽性發(fā)生。

為進(jìn)一步驗(yàn)證Ucaps-seq測(cè)序技術(shù)的有效性，研究人員首先在合成的DNA探針模型上驗(yàn)證了該測(cè)序技術(shù)的原理，然后在誘變后的癌癥細(xì)胞和B細(xì)胞中，驗(yàn)證了Ucaps-seq測(cè)序技術(shù)的單堿基分辨率效能，最后對(duì)基因編輯脫靶進(jìn)行了評(píng)估，發(fā)現(xiàn)該測(cè)序技術(shù)對(duì)基因編輯脫靶具有強(qiáng)大的識(shí)別能力。

“Ucaps-seq技術(shù)的誕生，特別是其檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，將像其他堿基檢測(cè)一樣便捷高效。”陳義漢說，“這將大大推進(jìn)核酸序列檢測(cè)、遺傳密碼破譯和人類對(duì)核酸的認(rèn)知。”(記者 張雙虎 黃辛)

關(guān)鍵詞： 人類健康 DNA序列檢測(cè) 單個(gè)堿基分辨率水平 脫氧尿嘧啶