生命的產(chǎn)生是一個神奇的過程，經(jīng)歷了受精卵分裂、胚胎發(fā)育和胎兒生長。其間伴隨著全身器官的發(fā)育和成熟，以及成百上千種細胞的擴增和分化，這決定了生物體的后期功能。

近日，美國洛克菲勒大學(xué)助理教授曹俊越因其在高通量單細胞測序技術(shù)以及發(fā)育生物學(xué)方面的成就，成為《科學(xué)》和SciLifeLab頒發(fā)的2020年度青年科學(xué)家獎特等獎全球唯一得主。11月20日，《科學(xué)》刊登了其獲獎短文，描述了有助于研究生命產(chǎn)生奧秘的4項高通量單細胞測序技術(shù)。

之前，11月13日，《科學(xué)》還刊登了洛克菲勒大學(xué)、華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院、羅特曼·巴蒂研究所等機構(gòu)研究人員利用這些新技術(shù)創(chuàng)造的兩個細胞圖譜，以追蹤人類細胞類型和組織發(fā)育過程中的基因表達和染色質(zhì)可及性。

從失敗中完善

“細胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能的最基本單位，為了解生命的產(chǎn)生過程，我們需要系統(tǒng)性地分析人體每一種細胞種類及其在發(fā)育過程中的動態(tài)變化和分子機理。”曹俊越在接受《中國科學(xué)報》專訪時表示，而傳統(tǒng)手段受限于檢測的靈敏性，無法對人體的幾百種細胞進行全面檢測和比較。

近幾年，單細胞測序技術(shù)，尤其是單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，通過同時檢測單細胞幾萬種基因的表達，精確定義了細胞的分子學(xué)狀態(tài)，從而被廣泛應(yīng)用于檢測新的細胞種類，以及研究發(fā)育和疾病對細胞狀態(tài)的影響。但目前的單細胞測序技術(shù)只能檢測幾千個細胞，遠遠低于正常人體組織包含的細胞數(shù)目(百萬級)，同時耗材費用昂貴，因此無法全面檢測人體組織中的細胞種類和變化。

為了解決這一問題，在華盛頓大學(xué)Jay Shendure實驗室4年讀博研究期間，曹俊越研發(fā)了高通量單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(sci-RNA-seq)等4項高通量單細胞測序技術(shù)。

“相對于傳統(tǒng)的生物學(xué)領(lǐng)域，新技術(shù)研發(fā)的困難主要在于要發(fā)明自然界中不存在的新事物，因此這一過程風(fēng)險很高，往往要經(jīng)歷很多失敗和挫折。”曹俊越回憶道，在研發(fā)sci-RNA-seq的最初過程中，他用兩年時間反復(fù)嘗試了262種實驗條件才摸索出最初的技術(shù)雛形。

之后，研究人員又實驗了超過1718種條件組合來優(yōu)化sci-RNA-seq，從而使這項技術(shù)可以真正用來分析上百萬個單細胞的基因表達圖譜。“大部分的實驗都沒有成功，但是沒有這些失敗和汗水，也就沒有最終完善的技術(shù)。”曹俊越說。

終于，基于組合標(biāo)記的sci-RNA-seq實現(xiàn)了不依賴于細胞分離的單細胞基因表達檢測。

4項技術(shù)

sci-RNA-seq被用于檢測超過5萬個線蟲單細胞的轉(zhuǎn)錄組測序，從而構(gòu)建了世界首個生物個體水平的單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜。研究人員繪制了27個主要細胞種類的基因表達圖譜，并監(jiān)測到各種罕見的神經(jīng)細胞種類。這些數(shù)據(jù)不僅在線蟲研究領(lǐng)域具有重大意義，而且為構(gòu)建其他生物物種的細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜提供了模板。

相對于線蟲，哺乳動物包括人的發(fā)育過程涉及更加多樣的細胞類型和復(fù)雜的分子程序。曹俊越等人研發(fā)了另一項高通量單細胞測序技術(shù)：sci-RNA-seq3。該技術(shù)可以同時檢測幾百萬個單細胞轉(zhuǎn)錄圖譜，其費用是以往技術(shù)的1/10。同時這項技術(shù)不依賴于特殊的儀器設(shè)備，可以廣泛應(yīng)用于世界大部分研究機構(gòu)。

研究人員首先用這項技術(shù)對小鼠主要器官的發(fā)育階段(胚胎期9.5天至13.5天)進行高精度單細胞水平的系統(tǒng)性研究。他們一共檢測到200萬個單細胞組成的500多個細胞種類，并系統(tǒng)性繪制了形成各種器官的細胞分化路徑以及每個路徑中幾萬種基因的表達變化。

針對目前大部分單細胞測序技術(shù)只能檢測基因表達而忽略其他分子水平變化的局限，曹俊越等人又研發(fā)了高通量單細胞雙圖譜測序技術(shù)sci-CAR，可以同時檢測上萬個單細胞的轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)，并成功構(gòu)建首個哺乳動物器官水平(腎臟)的單細胞雙圖譜。

此外，目前的單細胞測序技術(shù)依然局限于描述細胞的靜態(tài)而忽略了動態(tài)變化。延時顯微鏡可以通過實驗測量細胞的動態(tài)轉(zhuǎn)變，但僅限于研究培養(yǎng)皿中少數(shù)細胞的少數(shù)標(biāo)記基因，因此可能不足以解釋許多生物系統(tǒng)的復(fù)雜性。為此，曹俊越發(fā)明了sci-fate技術(shù)，用于研究大量單細胞在轉(zhuǎn)錄組水平的基因表達動態(tài)。這項技術(shù)通過結(jié)合sci-RNA-seq和4-硫尿苷(4sU)標(biāo)記新生mRNA技術(shù)，可以大規(guī)模分析幾千到幾百萬個單細胞轉(zhuǎn)錄組。

2017年至2020年，上述幾項成果發(fā)表于《自然》《科學(xué)》和《自然—生物技術(shù)》。

兩個圖譜

近日，研究人員使用這些技術(shù)，繪制了兩份新的圖譜：15種胎兒組織單個細胞內(nèi)的基因表達圖譜和細胞內(nèi)單個基因染色質(zhì)可及性圖譜。

基因表達是細胞使用儲存在DNA中的指令指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的過程。而這些蛋白質(zhì)又決定了細胞的結(jié)構(gòu)和功能。基因表達圖譜繪制了不同類型細胞生長發(fā)育過程中發(fā)生基因表達的時間和地點。

華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院基因組學(xué)教授Jay Shendure告訴記者：“這一領(lǐng)域的總體目標(biāo)是在盡可能大的范圍內(nèi)，以盡可能高的分辨率描繪人體遺傳程序。”

為了繪制圖譜，研究人員使用sci-RNA-seq3技術(shù)，對15種胎兒組織的基因表達進行了分析。科學(xué)家分析了400多萬個單細胞，確定了77種主要細胞類型和大約650個細胞亞型。研究發(fā)現(xiàn)了一些新的細胞種類，并綜合分析了主要細胞類型(包括血液、內(nèi)皮細胞和上皮細胞)的器官特異性。

他們將人類胎兒單細胞圖譜和小鼠胚胎細胞圖譜整合在一起，并構(gòu)建了細胞和基因從胚胎到胎兒發(fā)育的動態(tài)軌跡。華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院基因組學(xué)副教授Cole Trapnell表示：“把這些數(shù)據(jù)和之前發(fā)表的數(shù)據(jù)結(jié)合起來，可以直接描繪出所有主要細胞類型的細胞發(fā)育路徑。”

第二份DNA可及性圖譜繪制了一種名為染色質(zhì)的物質(zhì)，這種物質(zhì)允許DNA緊密地排列在細胞核內(nèi)。“研究染色質(zhì)能讓你了解細胞的調(diào)控‘語法’。”亞利桑那大學(xué)助理教授Darren Cusanovich說。

在這項研究中，科學(xué)家在15種胎兒組織的約100萬個位點上生成了近80萬個單細胞染色質(zhì)可及性圖譜。他們分析了哪些蛋白質(zhì)可能與每個細胞中的DNA位點相互作用，以及這些相互作用如何解釋細胞類型。這種分析定義了基因組內(nèi)發(fā)育的控制開關(guān)。他們還確定了染色質(zhì)易接近的位點，這些位點可能與疾病有關(guān)。

“每一項新技術(shù)都是一扇新的窗戶，使我們可以領(lǐng)略這個世界獨一無二的風(fēng)景。通過研發(fā)更先進的技術(shù)，我們可以不斷超越前人和自己的局限性，同時用這些新技術(shù)探索生命的奧秘和美麗。”曹俊越說。(記者 唐鳳)

關(guān)鍵詞： 單細胞