為了監(jiān)測神經(jīng)活動進而理解神經(jīng)系統(tǒng)的功能機制，科學家們研發(fā)了不少高大上的“武器”。

近日，《美國化學會志》期刊報道了一項新研究成果。研究人員開發(fā)了一種可用近紅外光激發(fā)的電壓熒光納米探針，并用它成功監(jiān)測了斑馬魚和小鼠腦中神經(jīng)元膜電位的動態(tài)變化。活體監(jiān)測時，這種新“武器”表現(xiàn)不俗。

設計電壓敏感探針一直是個技術難關

群體神經(jīng)元活動的在體監(jiān)測是揭示神經(jīng)系統(tǒng)功能機制的關鍵。目前，神經(jīng)元鈣離子熒光成像是主要手段之一。然而，相比于神經(jīng)脈沖信號，鈣離子熒光信號的動力學相對較慢，且很難推斷出與之對應的神經(jīng)脈沖的頻率和數(shù)量。因此，神經(jīng)科學界迫切期望能開發(fā)出對細胞膜電位變化敏感、有高信噪比的納米粒子或分子探針，從而實現(xiàn)高時空分辨率、大范圍神經(jīng)元集群電活動的活體監(jiān)測。

現(xiàn)有的熒光電壓探針多用紫外光或可見光激發(fā)，由于這兩種光在活組織中易于吸收和散射，因此它們只能應用于大腦淺層。相比于可見光或紫外光，紅外光(750納米—l000納米)在生物組織中穿透能力更強，穿透深度可達厘米量級，能夠應用于大腦深層，被稱為“生物組織的光學窗口”。“因此，如何研發(fā)高靈敏、可用近紅外光激發(fā)的電壓敏感探針已成為目前國際神經(jīng)科學領域迫切希望攻克的技術難關之一。”中國科學院腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心/神經(jīng)科學研究所研究員杜久林對科技日報記者說。

稀土元素摻雜的上轉換熒光納米顆粒(UCNPs)是一類近紅外光激發(fā)，紫外、可見光多重發(fā)射的反斯托克斯發(fā)光納米材料。所謂反斯托克斯，即指物質的發(fā)射光波長短于激發(fā)光波長的反常現(xiàn)象。由于上轉換熒光納米顆粒具有低背景熒光、多重發(fā)射的特性，已在生物成像與活體診療的應用中獲得廣泛關注。

在這項研究中，研究人員設計和制備了一種基于上轉換熒光納米顆粒的電壓敏感探針。研究人員首先將上轉換熒光納米顆粒固定在細胞膜上，然后將六硝基二苯胺(DPA)嵌入細胞膜磷脂雙分子層。在細胞靜息狀態(tài)下，帶負電荷的六硝基二苯胺在細胞膜外側富集，上轉換熒光納米顆粒與六硝基二苯胺之間距離在10納米以內(nèi)，形成發(fā)光共振能量轉移效應(FRET)，上轉換熒光納米顆粒發(fā)光被六硝基二苯胺吸收，檢測到的光信號較弱。當細胞去極化后，六硝基二苯胺在電場作用下于細胞膜內(nèi)側富集，上轉換熒光納米顆粒與六硝基二苯胺之間距離超過10納米，發(fā)光共振能量轉移效應消失，從而恢復了上轉換熒光納米顆粒的發(fā)光。

探究活體組織中神經(jīng)元活動有了新思路

為驗證新研發(fā)的電壓納米探針在神經(jīng)元電活動檢測中的優(yōu)勢，研究人員應用該納米探針分別監(jiān)測了斑馬魚前腦神經(jīng)元的嗅覺反應和小鼠新皮層神經(jīng)元膜電位振蕩隨麻醉深度的變化。

神經(jīng)元的電活動動態(tài)性強，以往開發(fā)的基于熒光蛋白的電壓探針信噪相對較低，大都需要多次疊加才能得到清晰的感覺反應。同時，此類探針易被熒光淬滅，因此可記錄時間窗口較短，限制了其實用性。

“我們運用新開發(fā)的電壓納米探針，研究了斑馬魚前腦神經(jīng)元對食物刺激的反應。在近紅外光激發(fā)下，單次施加食物刺激即可顯著增強神經(jīng)元的熒光信號，并可在連續(xù)數(shù)次刺激下穩(wěn)定記錄。更重要的是，得益于上轉換熒光納米顆粒較低的淬滅程度，活體記錄時間可長達30分鐘，為數(shù)據(jù)收集提供了充足的時間窗口。”杜久林向記者介紹。

哺乳動物神經(jīng)元膜電位的閾下振蕩，反映了動物個體的腦狀態(tài)及其變化。在深度睡眠和麻醉狀態(tài)下，腦狀態(tài)主要是慢波;在動物趨于清醒時，慢波減弱甚至消失，代之以高頻電活動。傳統(tǒng)的鈣離子成像反映的神經(jīng)活動難以體現(xiàn)這種閾下膜電位振蕩，研究人員在小鼠初級體感皮層中注入電壓納米探針，并考察了戊巴比妥麻醉不同深度下的神經(jīng)元閾下膜電位活動。在深度麻醉狀態(tài)下，納米探針發(fā)光存在低頻振蕩現(xiàn)象，提示此狀態(tài)下閾下膜電位以慢波為主。通過機械刺激小鼠尾巴提高其清醒水平后，納米探針發(fā)光的低頻振蕩減弱，高頻電活動相對增強，在10分鐘后恢復至原有水平。此現(xiàn)象說明納米探針的發(fā)光強度可真實反映腦電活動的相應變化。

對此，杜久林表示，這項研究為設計可用近紅外光激發(fā)的電壓敏感探針提供了全新思路，為探究深層活體組織中群體神經(jīng)元活動開辟了實時動態(tài)監(jiān)測的新方法。(記者 陸成寬)

關鍵詞： 納米探針